Die Seidenproteine, Firboin und Sericin, des Seidenspinners Bombyx mori erlangten als Biomaterial in den vergangenen Jahren immer mehr an Bedeutung im Fachbereich der Regenerativen Medizin beispielsweise im Einsatz für die geführte Weichgewebs- und Knochenregeneration (Guided Tissue Regeneration / Guided Bone Regeneration). Beide Proteine bewährten sich durch ihre gute Biokompatibilität und pH-neutrale (proteolytische) Degradation bereits in zahlreichen In-vitro- und In-vivo-Studien. Aus implantologischer Sicht kann eine zusätzliche antibakterielle Wirkung als Primärprävention der Mucositis und/oder der Periimplantitis dienen.

Material und Methoden

Aus den extrahierten Seidenproteinen Fibroin und Sericin wurden gegossene Membranen (CM) und elektro-gesponnene Vliese (NW) mit verschiedenen antibakteriellen Beladungen hergestellt. 

Fünf Variationen an gegossenen Membranen (CM) wurden hergestellt: Fibroin-unbehandelt (CM-C), Fibroin-Silber (CM-Ag), Fibroin-Gentamicin (CM-G), Sericin-unbehandelt (CM-SSC) und Fibroin-Sericin (CM-SF/SS). Und drei Variationen an elektro-gesponnenen Vliesen wurden hergestellt: Fibroin-unbehandt (NW-C), Fibroin-Silber (NW-Ag), Fibroin-Gentamicin (NW-G).

Die Struktur der Fibroin Membranen und Fibroin Vliese wurde im Rasterelektronenmikroskop (REM) veranschaulicht. Für die antibakterielle Testung wurden auf die Proben über Nacht ein künstlicher Speichel gegeben, um die Oberflächen mit einem künstlichen Pellikel (a-Amylase 1mg/ml, Muzin 0,85mg/ml, BSA 0,4mg/ml) zu benetzen. Anschließend wurden die Probekörper kurz in PBS gewaschen und für den weiteren Versuch bereitgestellt. Je zehn Proben pro Variation wurden für einen Zeitraum von 48 Stunden inkubiert mit einem Mischkulturmedium aus den anaeroben Bakterienstämmen Streptococcus mutans (DSM 20523), Actinomyces naeslundii (DSM 17233), Fusobacterium nucleatum (DSM15643) und Porphyromonas gingivalis (DSM 20709). Im Anschluss wurde die Lebendbakterienzahl durch eine Colony Forming Unit (CFU) Analyse und die Gesamtbakterienzahl durch qrt-PCR mit einem ubiquitären 16S-rRNA Primern ermittelt. Eine direkte antibakterielle Wirksamkeit wurde anhand eines Hemmhoftests ermittelt (Abb. 1). Des Weiteren wurde die Biokompatibilität der Materialien mittels XTT-, LDH- und Live-Dead assay an L929 Mausfibroblasten untersucht. 

Ergebnisse

Rasterelektronenmikroskopie

Fibroin Vliese zeichnen sich durch eine starke Porosität aus, die durch die hohe Dichte der verflochtenen Fasern im Vergleich zur glatten Oberfläche des Fibroin/Sericin Membranen entsteht (Abb. 2 A, C). Querschnittsaufnahmen zeigen die Kontinuität der Faserverbindungen über die gesamte Dicke des Vliesstoffs (Abb.2 B, D). 

Membranen

Mit Silberionen funktionalisierte Fibroinmembranen (CM-Ag) zeigten eine signifikant geringere Gesamt- und Lebendbakterienzahl mit einer Reduktion der Bakterienzahl um 3 Logarithmusstufen (99,9 % Reduktion) im Vergleich zu unbehandelten Kontrollmembranen (CM-C und CM-SSC) und mit Gentamicin funktionalisierten Membranen (p <0,001) (Abb. 3 und Abb. 4). Im Hemmhoftest mit der Mischkultur konnte für Membranen mit Silber ein Hemmhof von 2 - 3 mm und für Membranen mit Gentamicin ein Hemmhof von 7 mm festgestellt werden (Abb.5).

Vliese

Mit Gentamicin funktionalisierte Fibroinvliese (NW-G) zeigten eine signifikant geringere Gesamt- und Lebendbakterienzahl im Vergleich zu unbehandelten Vliesen und mit Silberionen funktionalisierten Vliesen (p <0,001) (Abb.3 und Abb. 4). Im Hemmhoftest mit der Mischkultur konnte für Vliese mit Silber ein Hemmhof von 2 - 3 mm und für Vliese mit Gentamicin ein Hemmhof von 8 mm festgestellt werden (Abb.5).

Biokompatibiltät

Mit Ausnahme von Silber beladenen Proben zeigten alle Materialien eine Viabilität von > 70% der Negativkontrolle entsprechend der DIN EN ISO 10993-5:200 an. Gleichzeitig konnte im Live-Dead assay eine große Anzahl grüner Fluoresceindiacetat (FDA)-positiver vitaler Zellen mit nur vereinzelten roten Propidiumjodid (PI)-positiven toten Zellenauf allen Proben veranschaulicht werden (Abb.6 A, B).